利用BacillusmojavensisKJS-3菌株或其培养物促进植物生长及防止植物死亡的组成物的制作方法

日期:2019-08-04 05:29:31

利用Bacillus mojavensis KJS-3菌株或其培养物促进植物生长及防止植物死亡的组成物的制作方法
【专利摘要】本发明为了促进植物生长及减少死亡率,提供一种将Bacillus mojavensis KJS?3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株或其培养物作为有效成分进行包含的组合物,另外,本发明为了促进植物生长或减少死亡率,提供一种使Bacillus mojavensis KJS?3内生(root?endophytic)于植物的根部,从而促进植物生长并防止植物死亡的方法。KCCM10961P20080822
【专利说明】
利用Baci I lus mojavensis KJS-3菌株或其培养物促进植 物生长及防止植物死亡的组成物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种促进植物生长及防止植物死亡的组成物,涉及一种组成物,其利 用Bacillus mojavensis KJS-3促进植物生长及减少植物死亡率。
【背景技术】
[0002] 在植物的根部周围或根的内部生存着有害菌株,对植物造成负面影响。换句话说, 产生阻碍植物生长并使植物死亡的问题。因此,许多科学家正在进行通过在植物的周围撒 播有益菌株来给予植物帮助的研究。但是向植物进行撒播的情况下,随着菌株生长产生的 生成物质,特别是乳酸(Lactic acid)等的过量生成使酸度下降,在低酸度的酸性下会发生 植物枯死。因此,缺点在于无法使用高浓度菌株。尤其是,若下大雨散播在植物周围的菌 株一植物根际促生细菌(PGPR, Plant growth promoting rhizobacteria)会被雨水冲洗, 但是这种情况下若有水,霉会急剧生长,对植物造成危害。特别是,此时因为植物根际促生 细菌被雨水冲刷掉而不存在,所以有害霉的影响会变得更高。
[0003] 如此,为了解决对植物的根部周围和根的内部有害的菌株阻碍植物生长,并使植 物死亡的问题,通过使用在植物的周围撒播有益菌株来给予植物帮助的方法,但即使利用 植物原有乳酸菌或益生菌(probiotics)也较少看到显著效果,菌株在植物的根部周围很 难长时间存在。
[0004] 因此,寻找并开发具有如下特点的菌株的必要性很高:克服所述缺点,并特别是不 诱发酸性的同时对植物无害,而且即使大量使用也对植物发挥好的效果。
[0005] Bacillus mojavensis KJS-3(保藏编号:KCCM 10961P,保藏日期 2008. 08. 22, 以下称作"Moja-3")是通过本
【发明人】进行分离并完成种菌保藏(委托)的,在研究其效果 的过程中,可确认到在植物生长和死亡率降低方面具有显著效果,但其缺点在于,被雨水冲 走,以及雨后在植物根部周围接收到适量水分的植物有害霉和细菌急剧生长,从而死亡率 高且均一的植物生长促进作用不充分。由此,最终要开发在根内可生长的方法。换句话说, 目的在于,通过将Mo ja-3活用为根内内生菌株(Endophytic strain),从而进一步增加产 业用途。

【发明内容】

[0006] 本发明是为了解决与所述相同的现有问题而发明的,具有如下目的。
[0007] 本发明的目的在于提供一种组成物,其为了促进植物生长及减少死亡率,将 Bacillus mojavensis KJS-3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株或其培养物作为有效成分进行 包含。
[0008] 另外,本发明的目的在于提供一种方法,其中,为了促进植物生长或减少死亡率, 使Bacillus mojavensis KJS-3内生于植物的根部(root-endohpytic),从而促进植物生 长,并防止植物死亡。
[0009] 为达到所述目的,本发明具体体现为如下所述解决方法。
[0010] 本发明是一种促进植物生长及防止植物死亡的组成物,所述组成物将Bacillus mojavensis KJS-3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株或所述菌株培养物作为有效成分进行包 含,并且所述Bacillus mojavensis KJS-3菌株或其培养物为根部内生菌(endophyte)。
[0011] 并且,本发明是一种方法,其中,培养Bacillus mojavensis KJS_3(保藏编号: KCCM 10961P)菌株,从而进行孢子转换得到培养液,并将所述培养液或稀释液施肥于栽培 地,从而促进植物生长并防止植物死亡,所述稀释液是混合所述培养液和水后,将所述培养 液以100倍~300倍稀释的稀释液。
[0012] 另外,本发明是一种方法,其包括以下步骤:准备一公升(liter)水,其包含浓度 为 lX10ncfu/g 的 Bacillus mojavensis KJS-3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株;将 100kg 植物种子和所述准备的水混合并放置于温室中,将所述Bacillus mojavensis KJS-3菌株 附着在所述植物种子的表面;以及播种、栽培所述植物种子。并且将促进植物生长、防止植 物死亡的所述Bacillus mojavensis KJS-3内生于植物的根部(root-endophytic),从而促 进植物生长并减少植物死亡。
[0013] 根据前述构成,本发明具有如下效果:
[0014] 本发明的效果在于,为了促进植物生长及减少死亡率,提供一种将Bacillus mojavensis KJS-3 (保藏编号:KCCM 10961P)菌株或其培养物作为有效成分进行包含的组 成物的同时,为了促进植物生长或减少死亡率,提供一种使Bacillus mojavensis KJS-3内 生于植物的根部(root-endophytic),从而促进植物生长并防止植物死亡的方法。
【附图说明】
[0015] 图1是对Bacillus mojavensis KJS-3菌株在中性酸度(pH 7. 2)中生长了 lxl09cfu/ml以上进行确认的照片。
[0016] 图2是孢子转换结果(营养细胞和孢子菌株)在显微镜下的观察结果照片。
[0017] 图3是从施肥Moja-3后培育的山养山参根部内分尚的菌。
[0018] 图4是生长于冰箱中保存30日的山参种子表面的霉的照片。
[0019] 图5是在海拔600m上,将通过在Mo ja-3菌株的根部内处理所生长的山养山参,以 及山养山参表面利用无菌水清洗后放在无菌台(clean bench)上,用无菌处理的剃刀剃断 而制作成的山养山参根部的照片。
[0020] 图6是在图5剃断的山养山参根部中观察到的细菌照片及其放大照片。
[0021] 图7是在图6剃断的山养山参根部中添加杀菌生理盐水并混合的过程的照片。
[0022] 图8是从山养山参根部内长出的植物根部内生菌的生长状态照片。
[0023] 图9是以Moja-3菌株的不同生长温度特性,在20°C~50°C中生长特性的观察结 果,可以确认无法在15°(:和50°(:中生长的照片(在20°(:、25°(:、37°(:、48°(:中生长,在15 1€ 中未生长,在55°C中未生长)。
[0024] 图10是利用Bacillus mojavensis KJS-3保藏菌株和从山参根部内分离出的菌 株的Apizyme分析结果。
[0025] 图11是利用Bacillus mojavensis KJS-3保藏菌株和从山参根部内分离出的菌 株的Apizyme分析结果。
[0026] 图 12 是通过 Bp2 (Bacillus polyfermenticus KJS-2)、Bacillus mo javensis KJS-3.短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、以及对照群(Control),以山养山参为对象的5 年间的实验结果(确认Bacillus mojavensis KJS-3的效果非常好)。
[0027] 图 Π 是 Bacillus mo javensis KJS-3 的种菌保藏证。 具体实施例
[0028] 本发明涉及利用Moja-3菌株促进植物生长及防止死亡率。Moja-3是一种菌株,其 具有促进植物生长和抑制有害菌的效果,以及具有作为乳酸菌的特征。尤其,是一种无特殊 毒性、无毒力因子(Virulent factor)的安全菌株,特别是其还具有生长时在中性中生长的 特征,以及具有即使生成大量乳酸也能够维持酸度在6~7的特征。因此,即使大量使用在 植物中也没有因为酸性所致的危害。通过使用一定量以上的Moja-3可以降低植物死亡率、 促进植物生长。
[0029] 具体而言,Bacillus mojavensis KJS-3菌株通过孢子转换而制造。用适量的淀 粉稀释所述制造的菌株,从而和少量的水混合,并与种子混合,进而将Mo ja-3菌株附着于 种子表面。
[0030] 秋末时将具有所述附着的菌株的种子种于地里,等待春季发芽。如此发芽、充分生 长后,采集根部,并用杀菌蒸馏水清洗,移至无菌实验台,再一次做无菌清洗。之后用杀菌处 理的剃刀切碎,并悬浮为无菌培养基,取一定量的培养基移至固体培养基(培养皿培养基, Petri-dish medium)培养,培养后把握菌株特性,确认Moja-3菌株已进入根的内部生长。 以此找到一种可以在植物根内部放入所需的菌株的方法,另外确认所述方法,并可以观察 对植物生长或死亡率的影响。
[0031] 以下,参照实施例及附图对本发明进行具体说明。
[0032] 实施例1
[0033] 为了观察Moja-3菌株的生长特征,调节各个培养基的酸度(pH),并观察生长与 否。以下是分别在酸度2、酸度3、酸度4. 5、酸度6、酸度7. 5的培养基中的实验。此结果, 表明是在中性中生长的菌株。
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 0· D:0pticla Desity,光密度
[0037] 实施例2
[0038] 在利用自动发酵槽的培养中,Moja-3菌株在调节酸度(PH)的状态或不调节酸度 的状态中的生长一致,菌株的生长生长至2X10 9cfu/ml,在42°C中培养3日时99 %的菌株转 换成了孢子,并且在45°C中培养时,生长24小时后生长至2X109cfu/ml浓度,孢子转换率显 示为99% (参照图1及图2)。
[0039] 实施例3
[0040] 培养Moja-3菌株得到培养液,以200~300倍的水稀释后喷洒于山参的培养基 中。一周喷洒一次,并且一年内四个月反复进行喷洒。使用量为每10, 〇〇〇m2用80公升 (liter)。三年间所做实验的观察结果显示,对照群的山养山参生存率为40~45%,相反 地,Moja-3实验群改善为70~75%。另外,5年间实施的实验结果对照群的生存率降低至 3%,Moja-3实验群生存率为35%。实验完成后采集Moja-3实验群山养山参的根部,移至 实验室后,通过无菌操作分离根内部的菌株并培养。考虑到有大量的菌株和之后的发酵生 产,决定选择在37°C下,胰酶大豆琼脂(Tryptic soyagar)中生长。其结果为分离出具有各 种特征、样态的菌株,选择3种代表性的菌种进行培养并观察。其结果为Mo ja-3菌株消失, 遗传基因分析结果为使得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行了分离。也有和Moja-3 菌株具有相似特征的菌株,但随着所有菌株的生长,表现出酸性,并在与Moja-3菌株一起 生长的同时,不表现中性(参照图3)。
[0041] 实施例4
[0042] 将要进行处理Moja-3菌株的山参种子保管于冰箱中。经过30日左右后,观察所 述山参种子,即使在冷藏状态中生长的霉也会在种子的表面生长(参照图4)。其对植物生 长造成很大干扰,并且由此在种子内部放入Mo ja-3菌株,其通过存在于植物根部内来抑制 有害菌,对持续促进植物生长和减少死亡率做出贡献。
[0043] 实施例5
[0044] 在1公升(liter)含有lX10ncfu/g的Moja-3菌株的水中混合100kg山参种子,并 在温室中放置1日,使Mo ja-3附着于山参种子的表面。把所述种子栽培在海拔600m的高地 5年。采集所述培养的山养山参的根部,并用杀菌精制水清洗干净移至无菌实验台(Clean bench),用杀菌生理盐水再一次清洗。用杀菌处理的剃刀把山参根部剃成小段(参照图5)。 下一步是采集一部分在显微镜下观察结果,发现特殊的杆菌(参照图6)。
[0045] 实施例6
[0046] 把在实施例5中准备好的山参根部和杀菌生理盐水混合,并利用微量吸移管 (Micropipet)充分混合(参照图7)。然后利用微量吸移管每500 μ 1进行采集,分散在TSA 培养基(Trytic soy agar medium)中,并在37°C中培养16小时。此结果检测出推测为 Moja-3菌株的细菌,其比率显示为30%。总共1克的山养山参根部中生长有大约1,000个 细菌,并推测为大约30%为Moja-3 (参考图8)。
[0047] 实施例7
[0048] 在以上实施例6中生长的菌中占大约30%程度的菌推断确认为是Moja-3。首先 确认按照Moja-3的特征的不同温度的生长状态。原来Moja-3的生长温度是20°C至50°C, 观察在20°(:、25°(:、37°(:、48°(:下的生长状态,并追加观察在15°(:和55°(:下是否生长。其结 果确认为在15°C和55°C下不生长(参照图9)。
[0049] 实施例8
[0050] 作为分离的菌株的生物化学特征,确认Moja-3菌株是在根内部生存的植物根际 促生细菌(PGPR, Plant growth promot ing rhizobacterium)。将实验与保管的标准菌 株(KCCM 10961P)相比,其结果为相同。显示产生碱性磷酸盐(Alkaline phosphate)、 酯酶脂肪酶(C8) (esterase Lipase (C8))、亮氨酸氨基肽酶(Leucine arylamidase)、 α-糜蛋白酶(α -chymotrypsin)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase),β -半乳糖 苷酶(β-galactosidase)、α -葡萄糖苷酶(a-glucosidase)、β -葡萄糖苷酶 (β -glucosidase),并具有相同的结果。据此,可以确认本菌株Moja-3在植物的根内部生 长良好,另外若和种子一起培育,则发新芽时可以从缝隙中进入植物的根的内部生存。
[0051] 保藏编号
[0052] 分类命名:Bacillus mojavensis KJS-3
[0053] 保藏单位名称:韩国微生物保存中心(国外)
[0054] 保藏单位地址:韩国首尔市西大门区弘济1洞柳林B/D 361-221
[0055] 保藏编号:KCCM10%1P
[0056] 保藏日期:20080822
【主权项】
1. 一种促进植物生长及防止植物死亡的组成物,其特征在于: 将Bacillus mojavens is KJS-3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株或其培养物作为有效 成分进行包含。2. 根据权利要求1所述的促进植物生长及防止植物死亡的组成物,其特征在于: 所述Bacillus mojavensis KJS-3菌株或其培养物是根部内生菌。3. -种促进植物生长及防止植物死亡的方法,其特征在于: 培养Bacillus mojavensis KJS_3(保藏编号:KCCM 10961P)菌株,从而进行孢子转 换,进而得到培养液, 将所述培养液或稀释液施肥于植物的栽培地,从而促进植物生长及防止植物死亡,所 述稀释液是混合所述培养液和水后将所述培养液以100倍~300倍稀释的稀释液。4. 一种促进植物生长并防止植物死亡的方法,其特征在于,包括: 准备一升水,其包含浓度为IX 1011cfu/g的Bacillus mojavensis KJS_3(保藏编号: KCCM 1096 IP)菌株; 在所述准备的水中混合l〇〇kg植物种子并放置于温室中,将所述Baci 1 lus mo javensis KJS-3菌株附着在所述植物种子的表面;以及 播种并栽培所述植物种子, 将促进植物生长并防止植物死亡的所述Bacillus mojavensis KJS-3内生于植物的根 部,从而促进植物生长并防止植物死亡。
【文档编号】A01N63/00GK105831160SQ201510024537
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月16日
【发明人】姜载先, 康才杜, 郑泰城, 金江敏, 欧黎虹, 刘杰
【申请人】武汉虹睿生物科技开发有限公司, 庆星大学产学协力团, 康乐产业株式会社


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